研究人员还揭示了IV型分泌系统（T4SS）对于AIEC菌膜的形成以及维持其侵染力的必要性。
首先，作者应用了一种叫做转座子插入测序的高通量筛选技术。该技术通过在细菌基因组的不同部位插入转座子，介导基因突变，从而建立突变体库。基于这一技术，作者筛选了宿主体内AIEC增殖所必需的基因，并鉴定了377个潜在的遗传位点。
此外，作者还通过比较转录组学的方法鉴定了与AIEC宿主环境相关的基因表达谱。在许多已确定的代谢途径中，T4SS是AIEC毒性最重要的，它参与许多生物过程，包括蛋白质分泌、DNA转移和生物膜形成。
为了确定T4SS在AIEC感染中的作用，作者构建了T4SS功能缺陷株，并将其感染能力与宿主中的野生型菌株进行了比较。结果表明，与野生型菌株相比，T4SS缺陷型菌株的竞争力明显减弱。此外，在接种突变株的小鼠中，细菌完全消除的时间比野生型菌株早25天。在此基础上，作者发现T4SS缺陷可影响肠上皮细胞表面生物膜结构的形成，且小菌落数明显少于野生型菌株。
体内实验进一步证明了上述发现：接种突变株的小鼠肠上皮组织中AIEC小菌落的数量明显少于野生型菌株，表明其定殖能力受到显著影响。
除了AIEC，作者还观察到T4SS相关基因在40多种其他类型的克罗恩病相关致病性大肠杆菌中的高表达。这些结果表明，T4SS可以促进克罗恩病患者大肠杆菌的定植和生物膜的形成。
