近期，耶鲁大学Monkol Lek团队与上海交通(http://www.maoyihang.com/sell/l_19/)大学马凯玥博士合作，在《细胞》（Cell）杂志上发表了一篇题为“Saturation Mutagenesis-Reinforced Functional Assays (SMuRF) for Disease-related Genes”的研究论文。该研究介绍了一种名为SMuRF（饱和诱变助力的功能方法）的深度突变筛选工作流程，用于研究与疾病相关的基因突变。
SMuRF技术包括一个新颖且易于操作的成本效益型饱和诱变方法、一种改进的高灵敏度流式细胞仪功能测定法以及一系列独立验证的功能测定手段。这些技术组合起来，能有效地对多种疾病相关的基因进行快速高效的深度突变筛查。
为了证明SMuRF的有效性，研究团队将其应用于α-抗肌萎缩相关糖蛋白病（α-dystroglycanopathy）的关键致病基因FKRP和LARGE1的所有潜在单核苷酸变异的功能评估。研究结果表明，SMuRF不仅能够成功识别出这些突变，而且为探索各种罕见疾病的功能突变提供了一个强大的平台。
传统上，饱和基因组编辑（SGE）或饱和碱基编辑（SBE）作为主要的饱和诱变方法，由于其高昂的成本和依赖CRISPR系统而产生的编辑效率差异，限制了其在不具备CRISPR技术经验的实验室中的普及。相比之下，基于programmed allelic series（PALS）技术开发的PALS-C方法则能够无偏好地产生高覆盖率的突变，并且操作简单、成本较低。
在此基础上，研究者们还改进了流式细胞仪的功能测定方法，提高了对深度突变筛选（DMS）的检测灵敏度。利用SMuRF技术，研究团队对FKRP和LARGE1的遗传变异进行了详尽分析，并将所得结果与ClinVar和gnomAD数据库中的数据进行比对，确认了SMuRF评分与已知临床分类和变异频率的一致性。
进一步分析显示，SMuRF评分能较好地反映出FKRP相关疾病的严重程度，并且当与AlphaMissense等AI变异预测工具(http://www.maoyihang.com/sell/l_5/)的功能评分进行对比时，显示出提高AI预测准确性的潜力。通过将SMuRF评分映射到蛋白质结构上，研究揭示了与疾病密切相关的蛋白质区域。
为了确保SMuRF评分的可靠性，研究者还采用了基于LASV病毒侵入机制的高通量方法及免疫荧光染色技术，在肌肉细胞系中验证了α-DG糖基化水平及其与SMuRF评分的相关性。
总之，SMuRF提供了一种便捷且经济有效的饱和诱变方案，结合高通量功能筛选技术，有助于解决临床意义不明的变异问题，并在预测疾病严重程度、解析关键结构区域以及为计算预测模型提供训练数据集等方面展示了广阔的应用前景。
